Praktikum Kultur Jaringan

SUMBER KARBON : KARBOHIDRAT

Bahan tanaman/eksplan merupakan bagian kecil tanaman, bukan system yang lengkap sehingga membutuhkan suplai bahan nutrisi
paling baik sukrosa, lalu glukosa, maltosa dan rafinosa. Fruktosa dan galaktosa  kurang efektif; manosa dan laktosa  paling tidak efektif.
Konsentrasi optimum sukrosa tergantung jenis kultur. (1-5%)
Kenapa tanaman in vitro memerlukan sumber karbon ?
Heterotrof
Intensitas cahaya rendah
Sarana fotosintetik rendah
CO2 sebagai faktor pembatas

ARANG AKTIF

Arang yang sudah dipanaskan beberapa jam dengan uap atau udara panas
Fungsi :
Adsorpsi senyawa toksik dalam media (mis. Fenolik)
Adsorpsi zpt :
(1) Mencegah pertumbuhan
kalus yang tidak diinginkan
(androgenesis dan pucuk yang
akan diakarkan)
(2) Membantu embryogenesis
kultur dalam medium tanpa
auksin
Merangsang perakaran (mengurangi tingkat pencahayaan)
Konsentrasi : 0,5 – 6%
Kocok sampai agar membeku setelah sterilisasi supaya arang aktif merata dalam media

BAHAN PEMADAT
Media : Cair (statis, dikocok) dan Padat
Agar : campuran polisakarida dari spesies alga
Kandungan : sedikit unsure Ca, Mg, K dan Na
Keuntungan :
Agar membeku pada suhu < 450 C dan mencair pada 1000 C  kisaran suhu kultur agar beku stabil.
Tidak dicerna enzim tanaman
Tidak bereaksi dengan persenyawaan penyusun media
Kekerasan media dipengaruhi : (1) konsentrasi agar; (2) Jenis/merk agar; (3) pH media; (4) penambahan arang aktif (0,8 – 1 % menghambat pembekuan)
Konsentrasi : 0,6 – 1 %
Terlalu keras (konsentrasi tinggi) : menghambat difusi senyawa dari dan menuju eksplan  pengambilan hara berkurang dan zat penghambat dari eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan.
Pemadat lain : polisakarida dari mikroorganisme lain  Gelrite (Kelco ; Pseudomonas sp.); lebih bening dari pada agar, pemakaian gelrite lebih rendah dari pada agar (2 g/L media), agarosa (untuk kultur protoplas), gallan gum, gelatin

pH MEDIA

pH untuk sel tanaman 5.5 – 5.8
Pengaturan pH : pH meter  NaOH 0,1 N dan HCl 0,1 N
Penurunan pH setelah sterilisasi dg autoklaf
Membuat pH 7 sebelum sterilisasi
Penentuan pH setelah sterilisasi (dititrasi dengan NaOH/HCl steril)
pH terlalu rendah (< 5.1) :
Agar tidak beku sempurna/ lembek
Garam fosfat dan besi mengendap
Vit B1 dan asam pantotenat menjadi kurang stabil
Penyerapan ammonium dan besi berkurang
IAA dan GA menjadi kurang stabil

SELEKSI MEDIA

Spesies baru : MS atau B5 (MS + 2,5% sukrosa + 0,8% agar + ZPT)
Inisiasi Kalus : Kombinasi (2,4-D : 0,2 – 2 ppm + sitokinin : 0,5 – 1,5 ppm)
Multiplikasi Tunas : Sitokinin (misal BAP) 0,5 – 5 ppm
Inisiasi Akar : Auksin (misal IAA) 0,2 – 2 ppm
Seleksi konsentrasi zpt menggunakan matriks
Berdasarkan : buku, jurnal dll

PEMBUATAN MEDIA
Membuat larutan stok dari media yang akan digunakan :
Menghindari penimbangan yang berulang setiap kali membuat media
Timbangan untuk menimbang dalam jumlah kecil tidak tersedia di laboratorium
Pembuatan larutan stok dikelompokan menjadi :
Stok makro : tahan 4-8 minggu, larutan stok tunggal
Stok mikro : tahan 4-8 minggu, larutan stok campuran
Stok Fe : tahan 4-8 minggu, peka cahaya  botol
selimuti alumunium foil
Stok vitamin : tidak awet disimpan, larutan stok campuran
kecuali jika dijadikan perlakuan
Stok zpt : tahan 2-4 minggu
Dengan adanya stok larutan  pembuatan media dg teknik pengenceran dan pencampuran

Hal-hal yang harus diperhatikan :
Stok yang mengendap tidak dapat digunakan lagi ( konsentrasi terlalu tinggi atau larutan campuran terutama hara makro)
Beberapa bahan tidak tahan suhu tinggi dan cahaya
Stok yang terkontaminasi MO tidak dapat digunakan lagi  kebersihan kondisi simpan dijaga dan wadah larutan ditutup serapat mungkin
Vitamin dan zpt : bahan kimia organic, peka cahaya dan suhu tinggi  lemari es, dibuat tidak terlalu banyak agar cepat habis
Zpt yang bereaksi asam (auksin dan giberelin)  dilarutkan dengan penambahan beberapa tetes NaOH (basa) / alcohol 40% atau pemanasan
Zpt yang bereaksi basa (sitokinin)  beberapa tetes HCl 1 N atau pemanasan

PEMBUATAN Medium MS
Larutkan 30 g gula dalam beakerglass berisi akuades (+/- 300 mL)
Tambahkan larutan stok A – F masing-masing 10 mL
Tambahkan larutan stok mikronutrien 1 mL
Tambahkan larutan stok vitamin 10 mL
Tambahkan zat pengatur tumbuh sesuai kebutuhan
Tambahkan akuades sampai volume total hampir 1L
Atur pH medium
Tuangkan medium ke wadah yang lebih besar (2 L)
Tambahkan agar-agar 8 g , tambahkan akuades sampai volume 1 L
kemudian panaskan sambil diaduk sampai agar larut dan terlihat jernih
Tuangkan medium ke dalam botol kultur, tutup botol kultur dengan alumunium foil, beri label dengan spidol yang tahan air dan panas
Sterilisasi medium dengan autoklaf